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Zu 1. Punkt f:              Unterbliebene molekularbiologische Valldierungen

Um festzustellen, ob es sich bei den amplifizierten Produkten tatsächlich um Teile des SARS-CoV- 2-Genoms handelt, ist eine biomolekulare Validierung der PCR-Produkte unerlässlich. Für einen diagnostischen Test ist diese Validierung ein absolutes Muss.

Die Validierung der PCR-Produkte sollte durchgeführt werden, indem man entweder das PCR- Produkt in einem 1%igen Agarose-EtBr-Gel zusammen mit einem Größenindikator (DNA-Lineal oder DNA-Leiter) laufen lässt, so dass die Größe des Produkts abgeschätzt werden kann. Die Größe muss der berechneten Größe des Amplifikationsprodukts entsprechen. Noch besser ist es jedoch, das Amplifikationsprodukt zu sequenzieren.

Letzteres gibt 100% Sicherheit über die Identität des Amplifikationsprodukts. Ohne molekulare Validierung kann man sich über die Identität der amplifizierten PCR-Produkte nicht sicher sein. In Anbetracht der oben beschriebenen schweren Designfehler können die PCRProdukte alles sein.

Bei kleinen Fragmenten der qPCR (ca. 10obp) wird zusätzlich ein weiterer Aspekt im Drosten- Corman-Paper nicht erwähnt:

Es kann entweder ein 1,5°/o Agarosegel oder sogar ein Acrylamidgel sein.

Dass die PCR-Produkte des Drosten-Tests nicht auf molekularer Ebene valldlert wurden, Ist ein weiterer schwerer Fehler und macht den Test nutzlos.

Zu 1. Punkt g:      Positiv-und Negativkontrollen zur Bestätigung/Widerlegung des spezifischen

Virusnachweises

Die unbestätigte Annahme, die dem im Drosten-Corman-Paper beschriebenen Test zugrunde liegt, ist, dass SARS-CoV-2 das einzige Virus aus der SARS-ähnlichen Beta-Coronavirus-Gruppe ist, das derzeit Infektionen beim Menschen verursacht. Die Sequenzen, auf denen ihre PCR-Methode basiert, sind in silico-Sequenzen, die von einem Labor in China geliefert wurden, da zum Zeitpunkt der Entwicklung des PCR-Tests kein Kontrollmaterial von infektiösem (“live”) oder inaktiviertem SARS-CoV-2 für die Autoren zur Verfügung stand.

Der PCR-Test wurde daher unter Verwendung der Sequenz des bekannten SARSCoV als Kontrollmaterial für die Sarbeco-Komponente konzipiert (Dr. Adam Meijer, Co-Autor des Drosten-Corman-Papers in einem E-Mail-Austausch mit Dr. Peter Borger).

Bei allen Personen, die positiv auf den RT-PCR-Test, wie im Drosten-Corman-Paper beschrieben, getestet werden, wurde angenommen, dass sie mit SARS-CoV-infiziert Infektionen reagieren. Diese Annahme ist mit drei schweren Fehlern behaftet.

Erstens kann ein positiver Test auf die im Drosten-Corman-Paper beschriebenen RNA-Moleküle nicht mit einer “Infektion mit einem Virus” gleichgesetzt werden. Ein positiver RTPCR-Test zeigt lediglich das Vorhandensein von viralen RNA-Molekülen an. Wie schon oben erwähnt war der Drosten-Test nicht für den Nachweis des Virus in voller Länge, sondern bestenfalls (hätte es seine anderen schweren, ihn unbrauchbar machenden Mängel nicht gegeben) nur für den Nachweis eines Fragments des Virus ausgelegt.

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Zweitens konnte keine echte spezifische Positivkontrolle -bei der es sich um die SARSCoV-2-RNA gehandelt haben muss -zuverlässige Ergebnisse liefern.

Drittens heißt es im Drosten-Corman-Paper:

“Um zu zeigen, dass die Assays auch andere Fledermaus-assoziierte SARS-verwandte Viren nachweisen können, haben wir mit dem E-Gen-Assay sechs von Fledermäusen stammende Kotproben getestet, die von Drexler et al. [. .. ] und Muth et al. zur Verfügung stehen. Diese viruspositiven Proben stammten von europäischen Nashornfledermäusen. Der Nachweis dieser phylogenetischen Ausreißer innerhalb der SARS-verwandten Co V-Kategorie lässt vermuten, dass wahrscheinlich alle asiatischen Viren nachgewiesen werden. Dies würde theoretisch eine breite Sensitivität selbst im Falle mehrerer unabhängiger Akquisitionen von Virusvarianten aus einem Tierreservoir gewährleisten. “

Diese Aussage zeigt, dass das im RT-PCR-Test verwendete E-Gen, wie im Drosten-CormanPaper beschrieben, nicht spezifisch für SARS-CoV-2 ist. Die E-Gen-Primer weisen auch ein breites Spektrum anderer SARS-Viren nach.

Das Genom des Coronavirus ist das größte aller RNA-Viren, die den Menschen infizieren, und sie haben alle eine sehr ähnliche molekulare Struktur. Dennoch haben SARS-CoV-1 und SARS-CoV-2 zwei hochspezifische genetische Fingerabdrücke die sie von den anderen Coronaviren unterscheiden.

Es ist eine einzigartige Fingerabdruck-Sequenz (KTFPPTEPTEPKKDKKKKK) im N-Protein von SARS-CoV-1 und SARS-CoV-2 vorhanden, zweitens enthalten sowohl SARS-CoV-1 als auch SARS-CoV-2 das HE-Protein nicht, während alle anderen Coronaviren dieses Gen besitzen. Um also ein SARS-CoV-1-und SARSCoV-2-PCR-Produkt spezifisch nachzuweisen, hätte die obige Region im N-Gen das Amplifikationsziel sein müssen. Ein zuverlässiger diagnostischer Test sollte sich auf diese spezifische Region im N-Gen konzentrieren. Und gerade die PCR für dieses N-Gen wurde vom Drosten-Corman-Paper weder weiter validiert noch als Testgen empfohlen, weil sie mit der SARS-CoV-Originalsonde “nicht so empfindlich” sei.

Darüber hinaus macht das fehlen des HE-Gens sowohl bei SARS-CoV-1 als auch bei SARSCoV-2 dieses Gen zur idealen Negativkontrolle, um andere Coronaviren auszuschließen. Das Drosten- Corman-Paper enthält weder diese Negativkontrolle, noch enthält es andere Negativkontrollen. Der PCR-Test im Drosten-Corman-Paper enthält daher weder eine einzige Positivkontrolle noch eine Negativkontrolle, um das Vorhandensein anderer Coronaviren auszuschließen. Dies ist ein weiterer wesentlicher Konstruktionsfehler, der den Test für die Diagnose ungeeignet und unvalidierbar macht!.

Zu 1. Punkt h:             Die Standardarbeitsanweisung (SOP) Ist nicht verfügbar

Es sollte eine Standardarbeitsanweisung (Standard Operational Procedure, SOP) zur Verfügung stehen, die die oben genannten Parameter eindeutig spezifiziert, so dass alle Laboratorien in der Lage sind, exakt die gleichen Testbedingungen einzurichten. Eine validierte universelle SOP ist unerlässlich, da sie einen Vergleich der Daten innerhalb der Länder und zwischen den Ländern ermöglicht. Es ist sehr wichtig, alle Primer-Parameter eindeutig zu spezifizieren. Dies ist beim Drosten-Test nicht geschehen. Außerdem ist der Ct-Seite 50 von 54 Wert, der angibt, wann eine Probe als positiv oder negativ zu betrachten ist, nicht spezifiziert.

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Es wird auch nicht angegeben, wann eine Probe als mit SARS-eoV-Viren infiziert gilt. Wie oben gezeigt, kann der Test nicht zwischen Virus und Virusfragmenten unterscheiden, daher ist der et- Wert, der die Bewertung des Tests als positiv auslöst, besonders wichtig.

Dieser et-Wert hätte in der Standard-Arbeitsanweisung (SOP) beschrieben werden müssen, die online gestellt hätte werden müssen, so dass alle Laboratorien, die diesen Test durchführen, exakt die gleichen Randbedingungen haben. Die durch Drosten et al. unterlassene Erstellung einer solchen SOP ist als grob fahrlässig zu bezeichnen.

Den Labors steht es somit frei, den Test so durchzuführen, wie sie es für angemessen halten, was zu einer enormen Variationsbreite führt. Die Laboratorien in ganz Europa, ja – aufgrund der WHO- Empfehlung des Drosten-Tests: auf der ganzen Welt -stehen vor einer Menge Fragen. Welche Primer sollen sie bestellen? Welche Nukleotide sollen sie an den undefinierten Stellen eintragen? Welchen Tm-Wert sollen sie wählen? Wie viele PeR-Zyklen sollen sie durchführen? Und bei welchem et-Wert ist die Probe positiv? Und bei welchem et-Wert ist sie negativ? Und wie viele Gene sollen sie testen? Sollen alle Gene getestet werden? Oder nur das E und das RpRd-Gen, wie in Tabelle 2 des Drosten-eorman-Papers gezeigt? Oder auch das N-Gen? Und was ist ihre Negativkontrolle? Was ist ihre Positivkontrolle? Das Drosten-Corman-Paper Ist so vage und fehlerhaft aufgebaut, dass man In Dutzende verschiedene Richtungen gehen kann. Nichts ist standardisiert. es gibt keine SOP. alles bleibt ein Rätsel Es handelt sich bei dem Inhalt dieses Papiers um außerordentlich schlechte Wissenschaft.

Zu 1. Punkt i:              Folgen der oben beschriebenen schwere Mängel des Drosten-Tests

Der im Drosten-Corman-Paper beschriebene RT-PCR-Test enthält so viele molekularbiologische Designfehler (siehe oben), dass es nicht möglich ist, ihn zu validieren und eindeutige Ergebnisse zu erhalten. Es ist unvermeidlich, dass dieser Test eine enorme Anzahl so genannter “falsch-positiver Ergebnisse” erzeugt.

Die Definition von “falsch-positiv” ist eine negative Probe, die zunächst ein positives Ergebnis erzielt, aber nach erneuter Prüfung mit demselben Test negativ ist. Falsch-positiv sind fehlerhaft positive Testergebnisse, d.h. negative Proben, die positiv getestet werden. Und genau das findet sich in der Tat in der Drosten-Corman-Arbeit. Auf Seite 6 des Manuskript-PDFs zeigen die Autoren, dass selbst unter gut kontrollierten Laborbedingungen ein beträchtlicher Prozentsatz falsch positiver Ergebnisse mit diesem Test erzeugt wird:

“Bei vier einzelnen Testreaktionen wurde eine schwache anfängliche Reaktivität festgestellt, die jedoch bei erneuten Tests mit demselben Assay negativ war. Diese Signale waren nicht mit einem bestimmten Virus assoziiert, und für jedes Virus, bei dem eine anfänglich positive Reaktivität auftrat, gab es andere Proben, die dasselbe Virus in einer höheren Konzentration enthielten, aber nicht positiv getestet wurden. Angesichts der Ergebnisse der oben beschriebenen umfassenden technischen Qualifikation wurde der Schluss gezogen, dass diese anfängliche Reaktivität nicht auf die chemische Instabilität der Real-Time-PCR-Detection Probes und höchstwahrscheinlich auf Probleme bei der Handhabung zurückzuführen war, die durch die rasche Einführung neuer diagnostischer Tests und Kontrollen während

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dieser Auswertung verursacht wurden studieren’:

Der erste Satz dieses Auszuges ist ein klarer Beweis dafür, dass der im Drosten-Corman Paper beschriebene PCR-Test falsch positive Ergebnisse erzeugt. Selbst unter den gut kontrollierten Bedingungen des hochmodernen Charite-Labors sind vier von 310 Primärtests per Definition falsch positiv.

Vier negative Proben wurden zunächst positiv getestet und waren dann bei einem erneuten Test negativ. Dies ist das klassische Beispiel für ein falsch-positives Ergebnis.

Eine weitere für die Gesamtbetrachtung des Papiers aufschlußreiche erzählerische Beobachtung im obigen Auszug ist, dass die Autoren die falsch-positiven Ergebnisse als “Umgang mit Problemen, die durch die rasche Einführung neuer diagnostischer Tests verursacht werden”, wegerklären.

Zu 1. Punkt j:              Das Drosten-Corrnan-Paper wurde offensichtlich nicht von Fachkollegen

begutachtet

Vor der formellen Veröffentlichung in einer wissenschaftlichen Zeitschrift werden wissenschaftliche und medizinische Artikel traditionell durch “Peer Review” zertifiziert. Dabei lassen sich die Herausgeber der Zeitschrift von verschiedenen Experten -sogenannten “Gutachtern” -beraten, die das Paper bewertet haben und möglicherweise Schwachstellen in den Annahmen, Methoden und Schlussfolgerungen erkennen. In der Regel veröffentlicht eine Zeitschrift einen Artikel erst dann, wenn sich die Herausgeber davon überzeugt haben, dass die Autoren auf die Bedenken der Gutachter eingegangen sind und dass die vorgelegten Daten die in dem Paper gezogenen Schlussfolgerungen unterstützen.

Das Drosten-Corman-Paper wurde am 21. Januar 2020 bei Eurosurveillance eingereicht und am

22. Januar 2020 zur Veröffentlichung angenommen. Am 23. Januar war das Paper online. Am 17. Januar wurden alle wesentlichen Informationen und das Protokoll des Manuskripts bei der WHO veröffentlicht. Darüber hinaus wurde das Drosten-Corman-Paper am 21. Januar 2020 von der WHO empfohlen (noch bevor es veröffentlicht wurde!).

Es liegt damit auf der Hand das kein Peer-Review-Verfahren durchgeführt wurde. Normalerweise ist das Peer-Review-Verfahren ein zeitaufwändiger Prozess, da mindestens zwei Experten aus der Praxis das eingereichte Paper kritisch lesen und kommentieren müssen. Vierundzwanzig Stunden reichen einfach nicht aus, um ein gründliches Peer-Review durchzuführen. Jeder Molekularbiologe, der mit dem RT-PCR-Design vertraut ist, hätte die schwerwiegenden Fehler im Drosten- Corman-Paper beim Review-Prozess beobachtet.

Zu 1. Punkt k:             Interessenkonflikte

Es stellt sich heraus, dass zwei Autoren des Drosten-Corman-Papers, Christian Drosten und Chantal Reusken, auch Mitglieder des Editorial Board dieser Zeitschrift sind (7). Es besteht also ein schwerer Interessenkonflikt, der den Verdacht verstärkt, dass das Paper nicht von Fachkollegen begutachtet wurde.

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Zu 1. Punkt l:              Zusammenfassung, Das Drosten-Corman-Paper enthält die folgenden

spezifischen Fehler:

• Es gibt keinen spezifizierten Grund, diese extrem hohen Konzentrationen von Primern

in diesem Protokoll zu verwenden. Die beschriebene Konzentration führt zu erhöhter unspezifischer Bindung und PCR-Produktamplifikation, wodurch der Test als spezifisches Diagnostikum ungeeignet ist;

• Sechs nicht spezifizierte wackelige Positionen führen zu einer enormen Variabilität des Testdesigns pro Labor; die verwirrende unspezifische Beschreibung im Drosten-CormanPaper eignet sich nicht als operatives Standardprotokoll;
• Der Test kann nicht zwischen dem gesamten Virus und viralen Fragmenten unterscheiden. Daher kann der Test nicht als Diagnostikum für intakte (infektiöse) Viren verwendet werden;

– eine Differenz von 10° C w.r.t. der Glühtemperatur Tm für Primerpaar1 (RdRp_SARSr_F und RdRp_SARSr_R) ist ein sehr schwerer Fehler und macht das Protokoll als spezifisches Diagnosewerkzeug unbrauchbar;

• Ein großer Fehler ist die Auslassung der et-Wertes, die zu bestimmen haben, wenn eine Probe als positiv und negativ betrachtet wird. Dieser Ct-Wert findet sich auch nicht in zusätzlichen Einreichungen und offiziellen Veröffentlichungen/Nachträgen;
• die PCR-Produkte sind nicht auf molekularer Ebene validiert worden, was das Protokoll als spezifisches, die Diagnostik unter Werkzeug nutzlos macht;
• der PCR-Test enthält weder eine einzige Positivkontrolle zum Nachweis der Spezifität für SARS-CoV-2 noch eine Negativkontrolle zum Ausschluss anderer Coronaviren, was den Test für eine spezifische Diagnose ungeeignet macht;
• Höchstwahrscheinlich wurde das Drosten-Corman-Paper nicht von Fachkollegen begut

achtet;

• Für mindestens vier Autoren bestehen schwerwiegende lnteressenskonflikte, zusätzlich

zu der Tatsache, dass zwei der Autoren des Drosten-Corman-Papers (Christian Drosten

und Chantal Reusken) auch im Editorial Board von Eurosurveillance sitzen; am 29. Juli 2020 kam ein lnteressenskonflikt hinzu (Olfert Landt ist CEO von TIB-Molbiol; Marco Kaiser ist Senior Re- searcher bei Gen Express und fungiert als wissenschaftlicher Berater für TIB-Molbiol), der in der ursprünglichen Version nicht deklariert wurde (und in der PubMed Version immer noch fehlt). TIB- Molbiol ist die Firma, die “als erste” PCR-Kits (Light Mix) auf der Grundlage des im Drosten-Cor- man-Manuskript publizierten Protokolls herstellte und diese PCR-Testkits aufgrund ihrer eigenen Worte vor der Einreichung der Publikation weltweit verteilte. Weiterhin versäumten Victor Corman & Christian Drosten, ihre zweite Zugehörigkeit zu erwähnen: das kommerzielle Testlabor “Labor Berlin”, wo sie für die Virusdiagnostik zuständig sind.

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Literaturhinweise:

• “Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCo V) by real-time RT-PCI?’, Euro Surveillance, 2020; Band 25, 3. Ausgabe (Euro Surveillance 2020;25[3]:pii=2000045) https://www.eurosurveillance.org/content/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045
• Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan Virenkulturen zur Beurteilung der Infektiosität von Covid-19. Systematische Überprüfung.

doi: https:// doi.org/ 10.1101/ 2020.08.04.20167932 https://www.medrxiv.org/content/1o.1101/2020.o8.o4.20167932v4

• Marra MA, Steven JMJ, Carotine RA, Robert AH, Angela BW et al. (2003) Wissenschaft.

Die Genomsequenz des SARS-assoziierten Coronavirus. Wissenschaft 300(5624): 1399- 1404.

• Sequenz kann hier gefunden werden: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ MN908947
• Borger P. Ein SARS-ähnliches Coronavirus wurde erwartet, aber es wurde nichts unternommen, um darauf vorbereitet zu sein. Am J Biomed Sei Res 2020. https://biomed.hu com/pdf /A)BSR.MS.ID.001312.pdf
• https://www.researchgate.net/publication/34112oz50_A_SARS-like_Corona-virus_was_Expect- ed but_nothing_was_done_to_be_Prepared
• https://www.eurosurveillance.org/upload/site-assets/imgs/202o-09-Editorial%20 Vorstand%20PDF.pdf
• Offizielle WHO-Empfehlung für das Corman / Drosten RT-qPCR-Protokoll, das sich direkt aus der Eurosurveillance-Publikation ableitet:

https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-V2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c 2

• Prim er-BLAST, NCBI -National Center for Biotechnology Information: https: //www .ncbi .n lm.n gov /tools/pri mer-blast/
• Trestan Pillonel et a/., Brief an den Herausgeber: SARS-CoV-2-Nachweis mittels Echtzeit- RT-PCR

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/

• Kirn et al, Die Architektur des SARS-CoV-2 Transkriptoms https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/Soo92867420304o62
• Wolfe! et al, Virologische Beurteilung von hospitalisierten Patienten mit COVID-2019 https://www.nature.com/articles/s41586-o2o-2196-x

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Zu 1. Punkt m:            Einige Inhalte zu Viren und öffentlicher Gesundheit von Michael Yeadon,

ehemaliger Vizepräsident von Pfizer: