Leszámolás a PCR teszttel

A SARS-CoV-2 kimutatására vonatkozó RTPCR-teszt külső szakértői vizsgálata 10 fő tudományos hibát tár fel molekuláris és módszertani szinten: a hamis pozitív eredmények következményeit.

Pieter Borger(1 * ),Bobby Rajesh Malhotra(2)  , Michael Yeadon(3)  , Clare Craig(4) Kevin McKernan(5) , Klaus Steger(6) , Paul McSheehy(7) , Lidiya Angelova(8)
Fabio Franchi(9), ThomasBinder(10), HenrikUllrich(1 , Makoto Ohashi(12)
Stefano Scoglio(13),Marjolein Doesburg-van Kleffens(14),Dorothea Gilbert(15)  Rainer Klement(16), RuthSchruefer(17),Berber W. Pieksma(18), JanBonte(19) Bruno
H. Dalle Carbonare(20), KevinP. Corbett(21),Ulrike Kämmerer(22)

Absztrakt

“Az “Új koronavírus kimutatása (2019-nCoV) valós idejű RT-PCR-sel” (Eurosurveillance 25(8) 2020) című kiadványban a szerzők diagnosztikai munkafolyamatot és RT-qPCR protokollt mutatnak be a 2019-nCoV (ma SARS-CoV-2) kimutatására és diagnosztikára, amelyet állításuk szerint validálnak, valamint a közegészségügyi laboratóriumi környezetben való felhasználás megbízható diagnosztikai módszertana. Az e kiadványnak a világ társadalmára gyakorolt valamennyi következményére való fényében független kutatók egy csoportja pontról pontra értékelte a fent említett kiadványt, amelyben 1) a bemutatott vizsgálati terv valamennyi componensét keresztbe ellenőrizték, 2) az RT-qPCR protokollajánlásokat a helyes laboratóriumi gyakorlat tekintetében értékelték, és 3) a szakterületre vonatkozó szakirodalommal összevetett paramétereket.
A 2019-nCoV felderítésére és diagnosztikára kiadott RT -qPCR protokoll és a kézirat számos technikai és tudományos hibától szenved, beleértve az elégtelen alapozó tervezést, a problémás és elégtelen RT-qPCR protokollt, valamint a pontos vizsgálati validáció hiányát. Sem a bemutatott teszt, sem maga a kézirat nem felel meg az elfogadható tudományos publikáció követelményeinek. Továbbá a szerzők súlyos összeférhetetlenségét nem említik. Végezetül, a közzététel benyújtása és elfogadása közötti nagyon rövid idő (24 óra) azt jelenti, hogy itt vagy nem végeztek szisztematikus szakértői értékelést, vagy problémás rossz minőségűek voltak.

Meggyőző bizonyítékokat szolgáltatunk számos tudományos elégtelenségről, hibáról. Figyelembe véve az itt bemutatott tudományos és módszertani hibákat, biztosak vagyunk benne, hogy az Eurosurveillance szerkesztőbizottságának nincs más választása, mint visszavonni a kiadványt.”

TÖMÖR FELÜLVIZSGÁLATI JELENTÉS

Ez a cikk a Corman-Drosten cikk számos súlyos hibáját mutatja be, amelyek jelentősége a SARS-CoV-2-nek tulajdonított és a COVID-19 betegséghez társított fertőzések világszerte való téves diagnosztizálásához vezetett. Szigorú zárlatokkal kell szembenéznünk, amelyek sok ember életét és megélhetését tönkretették, az oktatáshoz való korlátozott hozzáférés, és ezek a kormányok által a világ minden tájáról bevezetett korlátozások közvetlen támadást jelentenek az emberek alapvető jogai és személyes szabadságai ellen, amelyek egész gazdaság számára járulékos kárt okoznak. világviszonylatban.
Tíz végzetes probléma merül fel a Corman-Drosten cikkel kapcsolatban, amelyeket a következő szakaszokban részletesebben ismertetünk és elmagyarázunk.
Az első és legfontosabb kérdés, hogy a Coronavirus SARS-CoV-2 regény (a 2019-nCoV nevű kiadványban, 2020 februárjában pedig a vírusszakértők nemzetközi konzorciumának neve SARS-CoV-2 néven) in silico (elméleti) szekvenciákon alapszik. , amelyet egy kínai laboratórium szállított [1], mert abban az időben sem a fertőző („élő”), sem inaktivált SARS-CoV-2 kontrollanyaga, sem a vírus izolált genomi RNS-je nem állt a szerzők rendelkezésére. A szerzőség a mai napig nem végzett validálást izolált SARS-CoV-2 vírusok vagy ezek teljes hosszúságú RNS-e alapján. Corman és munkatársai szerint:

“Célunk egy robusztus diagnosztikai módszertan kidolgozása és bevezetése volt a közegészségügyi laboratóriumokban történő felhasználáshoz, anélkül, hogy vírusanyagok álltak volna rendelkezésre.” [1]

A hangsúlyt a két megfogalmazott célra kell helyezni: a) diagnosztikai teszt fejlesztése és b) közegészségügyi laboratóriumi körülmények között történő felhasználása. Ezek a célok nem érhetők el tényleges vírusanyag rendelkezésre állása nélkül (például a fertőző vírusterhelés meghatározásához). Mindenesetre csak egy maximális pontosságú protokoll lehet kötelező és elsődleges cél bármely ilyen nagyságrendű forgatókönyv-kimenetelnél. A kritikus vírusterhelés meghatározása kötelező információ, Christian Drosten csoport felelőssége e kísérletek elvégzése és a döntő adatok megadása.

“A rendelkezésre álló vírus izolátumok vagy eredeti betegminták hiányában tervezett diagnosztikai munkafolyamat létrehozása és validálása a 2019-nCoV szűréshez és egyedi megerősítés. A tervezést és validálást a 2003-as SARS-CoV-hez való szoros genetikai rokonság tette lehetővé, és szintetikus nukleinsav-technológia alkalmazása segítette. “

A reverz transzkripció-polimeráz láncreakció (RT-PCR) fontos biomolekuláris technológia a ritka, előre ismert RNS-fragmensek gyors kimutatására. Az első lépésben a mintában jelenlévő RNS-molekulákat reverz átírással kapjuk meg a cDNS-t. A cDNS-t ezután a polimeráz láncreakcióban amplifikálják egy specifikus primer pár és egy hőstabil DNS polimeráz enzim alkalmazásával. A technológia rendkívül érzékeny, és kimutatási határa elméletileg 1 cDNS-molekula. A PCR specifitását nagyban befolyásolják a biomolekuláris tervezési hibák.
Mi fontos az RT-PCR teszt és a Corman-Drosten publikációban leírt kvantitatív RT-qPCR teszt tervezésénél?

 

1. Az alapozók és a szondák:
a) a primerek és a próbák koncentrációjának optimális tartományban kell lennie (100-200 nM)
b) specifikusnak kell lennie az amplifikálni kívánt célgénre
c) optimális százalékos GC-tartalommal kell rendelkeznie a teljes nitrogén-bázisokhoz viszonyítva (minimum 40%, maximum 60%)
d) a vírusdiagnosztika érdekében legalább 3 primer párnak 3 vírusgént (lehetőleg a lehető legtávolabb a vírusgenomban) kell kimutatnia.

2. Az a hőmérséklet, amelyen az összes reakció lejátszódik:
a) DNS olvadási hőmérséklete (> 92 °)
b) DNS-amplifikációs hőmérséklet (TaqPol-specifikus)
c) Tm; a hőkezelési hőmérséklet (az a hőmérséklet, amelyen a primerek és a próbák eljutnak a megkötés / leválás célpontjába, és nem haladhatja meg a 2 ° C-ot primerpáronként). A Tm nagymértékben függ a primerek GC-tartalmától

3. Az amplifikációs ciklusok száma (kevesebb, mint 35; előnyösen 25-30 ciklus);
Vírus kimutatása esetén> 35 ciklus csak azokat a jeleket észleli, amelyek nem korrelálnak a fertőző vírussal, amelyet a sejttenyészetben végzett izolálás határoz meg [áttekintve a 2. részben]; ha valakit PCR-tesztként pozitívnak tesztelnek, ha 35 ciklus vagy annál magasabb küszöböt alkalmaznak (amint ez a legtöbb laboratóriumban Európában és az Egyesült Államokban van), annak valószínűsége, hogy az illető valóban fertőzött, kevesebb, mint 3%, annak valószínűsége, hogy az eredmény hamis pozitív, 97% [áttekintve 3-ban]

4. Molekuláris biológiai validációk; az amplifikált PCR-termékeket vagy a termékek gélben futtatásával, DNS-vonalzóval, vagy közvetlen DNS-szekvenálással kell validálni

5. Pozitív és negatív kontrollokat kell meghatározni a vírus specifikus kimutatásának megerősítésére / cáfolására

6. Rendelkeznie kell egy szabványos működési eljárással (SOP)

A SOP egyértelműen meghatározza a fenti paramétereket, hogy minden laboratórium pontosan ugyanazokat a vizsgálati feltételeket tudja felállítani. A validált univerzális SOP megléte elengedhetetlen, mert lehetővé teszi az adatok összehasonlítását országon belül és országonként.
Kisebb jelentőségű aggodalmak a kormánnal leöntött papírral
1. A Corman-Drosten cikk 1. táblázatában különböző rövidítések vannak megadva – „nM” van megadva, „nm” nincs. Ami a helyes nómenklatúrát illeti, a nm jelentése „nanométer”, ezért az nm-nek itt nM-et kell olvasnia.
2. Általános konszenzus, hogy a genetikai szekvenciákat mindig az 5’-3 ’irányba írjuk, ideértve a reverz primereket is. Rendkívül szokatlan a primer szekvencia fordított komplementer írásával való összehangolás, ahogy a szerzők a Corman-Drosten cikk 2. ábráján tették. Ezenkívül egy ingatag alapot „y” -ként jelölünk, anélkül, hogy leírnánk az Y-t.
3. A Corman-Drosten cikkben szereplő két félrevezető buktató az, hogy 1. táblázatuk nem tartalmazza a Tm-értékeket (hőkezelési hőmérsékleti értékek), és nem mutatja a GC-értékeket sem (a G és C száma a szekvenciákban% értékként összes bázis).

FŐBB ÖSSZEFOGLALÁSOK A Corman-Drosten PAPÍRRAL

A) HÁTTÉR
A szerzők tudományos munkájuk hátterét a következőképpen mutatják be: „A nemrégiben megjelent új koronavírus (2019-nCoV) folyamatos kitörése kihívást jelent a közegészségügyi laboratóriumok számára, mivel a vírusizolátumok nem állnak rendelkezésre, miközben egyre több bizonyíték van arra, hogy a járvány kiterjedtebb, mint eleinte azt gondolták, és az utazók révén a nemzetközi terjedés már megtörténik ”
A BBC News [4] és a Google Statistics [5] szerint világszerte 6 haláleset történt 2020. január 21-én – a kézirat benyújtásának napján. Miért vállalták a szerzők a közegészségügyi laboratóriumok számára a kihívást, miközben abban az időben még nem volt érdemi bizonyíték arra, hogy a járvány kiterjedtebb lenne, mint azt eredetileg gondolták?

 

Mi a fontos az RT-PCR teszt és a Corman-Drosten kiadványban leírt qu antitative RT-qPCR teszt tervezésekor?

1. Az alapozók és szondák:
  1. a) az alapozók és szondák koncentrációjának optimális tartományúnak kell lennie (100-200 nM)
  2. b) specifikusnak kell lennie arra a cél génre, amit fel szeretne erősíteni
  3. c) a GC-tartalom optimális százalékával kell rendelkeznie az összes nitrogénbázishoz viszonyítottan (minimum 40%, maximum 60%)
  4. d) vírusdiagnosztikában legalább 3 primerpárnak 3 vírus gént kell kimutatnia (lehetőleg a vírus genomjának lehető legszűkebben)
2. Az a hőmérséklet, amelyen mindez a reakció megtörténik:
  1. a) DNS olvadási hőmérséklet (>92°)
  2. b) DNS erősítő hőmérséklet (TaqPol specifikus)
  3. c) Tm; a lágyítási hőmérséklet (az a hőmérséklet, amelyen az alapozók és a szondák elérik a célkötést/leválást,alapozópáronként nem haladhatja meg a 2 ̊C-t). A Tm nagymértékben függ az alapozók GC tartalmától
3. Az erősítési ciklusok száma (kevesebb, mint 35; lehetőleg 25-30 ciklus);

Vírusészlelés esetén a >35 ciklus után csak olyan jeleket észlelnek, amelyek nem korrelálnak az infectious vírussal a sejttenyészet izolációja alapján [2. felülvizsgálat]; ha valakit a PCR pozitívként tesztel, ha 35 ciklusos vagy annál magasabb küszöbértéket használnak (mint a legtöbb európai és amerikai laboratóriumban),annak valószínűsége, hogy az említett személy tényleges fertőzött, kevesebb, mint 3%, annak valószínűsége, hogy az említett eredmény hamis pozitív, 97% [3- ban felülvizsgálva]

4. Molekuláris biológiai validálások; a felerősített PCR-termékeket vagy a termékek DNS-vonalzóval való gélben való futtatása, vagy közvetlen DNA szekvenálással kell validálni.
(5) Pozitív és negatív kontrollokat kell megadni a specifikus vírusészlelés megerősítésére/cáfolatára
6. Rendelkezésre kell állnia egy szabványos működési eljárásnak (SOP)

Az SOP egyértelműen meghatározza a fenti paramétereket, hogy minden laboratórium pontosan ugyanazokat a vizsgálati feltételeket tudja beállítani. Az érvényesített univerzális SOP elengedhetetlen, mivel lehetővé teszi az adatok összehasonlítását az országokon belül és országok között.   A Cikk folytatása>>>

Leszámolás a PCR teszttel