Leszámolás a PCR teszttel

KISEBB AGGODALMAK A CORMAN-DROSTEN Irattal KAPCSOLATBAN

  1. A Corman-Drosten papír 1. Továbbá a helyes nómenklatúra tekintetében az nm azt jelenti, hogy “nanométer”, ezért az nm-nek itt kell olvasnia az nM-et.
  2. Ez az általános konszenzus, hogy írjon genetikai szekvenciákat mindig az 5′-3′ irányba, beleértve a fordított primereket. Ez nagyon szokatlan, hogy nem összehangolt fordított kiegészítő írásban a primer sorozat, mint a szerzők nem ábra 2 a Corman-Drosten papír. Itt továbbá az imbolygó bázist “y”-ként jelölik meg az Y által képviselt bázisok leírása nélkül.
  3. A Corman-Drosten-papír két félrevezető buktatója az, hogy az1.

A CORMAN-DROSTEN-PAPÍRRAL KAPCSOLATOS FŐBB AGGÁLYOK

A) HÁTTÉR

A szerzők bemutatják tudományos munkájuk hátterét: “A nem rég megjelent új koronavírus (2019-nCoV) folyamatos kitörése kihívást jelent a közegészségügyilaboratóriumok számára, mivel a vírus izolátumok nem állnak rendelkezésre, miközben egyre több bizonyíték van arra, hogy a járvány elterjedtebb, mint azt eredetileg gondolták, és az utazókon keresztüli nemzetközi terjedés is már előfordult”.

A BBC News [4] és a Google Statistics [5] szerint 2020. január 21-én világszerte 6 haláleset történt – aznap, amikor a kéziratot benyújtották. Miért vállalták a szerzők a közegészségügyi laboratóriumok számára ezt a kihívást, miközben akkor nem volt érdemi bizonyíték arra, hogy a járvány sokkal szélesebb körű volt, mint azt eredetileg gondolták?

A szerzők kijelentették, hogy egy megbízható diagnosztikai módszertant dolgoznak ki és alkalmaznak a közegészségügyi laboratóriumi környezetben való használatra anélkül, hogy vírusanyag áll rendelkezésre. Elismerik továbbá, hogy “Ez a tanulmány bizonyítja, hogy a nemzeti és európai kutatóhálózatokban az akadémiai és állami laboratóriumok koordinálása révén óriási válaszképesség érhető el.”

B) MÓDSZEREK ÉS EREDMÉNYEK

1. Primer és szonda tervezés

1a) Hibás alapozók koncentrációja Megbízható és
pontos PCR-vizsgálati protokollokat általában 100 nM és 200 nM között terveznek alapozónként [7]. A Corman-Drosten papírban szokatlanul magas és változó primer koncentrációkat figyelünk meg több primernél (1. táblázat). A RdRp_SARSr-F  és RdRp_SARSr-R alapozópárok esetében 600 nM és 800 nM van leírva. Hasonlóképpen, a N_Sarbeco_F és N_Sarbeco_R alapozó készlet esetében 600 nM, illetve 800 nM-et tanácsolnak [1].

Egyértelműnek kell lennie, hogy ezek a koncentrációk elég magasak ahhoz, hogy optimalis specifikus erősítést adjanak a cél gének. Nincs meghatározott ok arra, hogy használja ezeket a rendkívül magas koncentrációjú primereket ebben a protokollban. Ehelyett ezek a koncentrációk fokozott, nem specifikus kötődéshez és PCR-termékek erősítéséhez vezetnek.

1 táblázat: Primerek és szondák (Corman-Drosten papírból adaptálva; hibás alapozó koncentrációk kiemelve)

 

1b) Meghatározatlan (“Wobbly”) primer és szonda szekvenciák Reprodukálható és összehasonlítható eredmények eléréséhez elengedhetetlen a primerpárok megkülönböztető meghatározása. A Corman-Drosten dolgozatban hat meghatározatlan pozíciót figyeltünk meg, amelyek R, W, M és S betűkkel voltak feltüntetve (2. táblázat).

A W betű azt jelenti, hogy ebben a helyzetben lehet A vagy T; R azt jelenti, hogy lehet G vagy A; M arra a vádra,hogy a pozíció lehet A vagy C; az S betűazt jelzi, hogy ebben a pozícióban G vagy C lehet. Ez a nagy számú változatok nem csak szokatlan, de ez is nagyon zavaró a laboratóriumokban. Ez a hat meghatározatlan pozíció könnyen eredményezhettöbb különböző alternatív primer szekvenciát, amelyek nem kapcsolódnaka SARS-CoV-2-2-hez (2 különböző RdRp_SARSr_F primer + 8 különböző RdRp_SARS_P1 szonda + 4 különböző RdRp_SARSr_R). A tervezési variációk elkerülhetetlenül olyan sults-khozvezetnek, amelyek még csak nem is a SARS CoV-2-vel kapcsolatosak. Ezért a Corman-Drosten papír zavaros, nem specifikus leírása nem alkalmas szabványos működési protokollkénti használatra. Ezeket a meghatározatlan pozíciókat egyértelműen meg kellett volna tervezni.
Ezek a remegő sequences már létrehozott egy aggodalomra okot adó forrást a területen, és azt eredményezte, hogy egy levelet a szerkesztő szerzője Pillonel és mtsai. [8] kapcsolatos kirívó hibákat a leírt szekvenciák. Ezek a hibák magától értetődő a Corman és mtsai. kiegészítés is.

A WHO-protokoll (1. ábra), amely közvetlenül a Corman-Drosten-papírból származik, arra a következtetésre jut, hogy aSARS-CoV-2 p resence megerősítéséhez két kontroll gént (az E-és RdRp-géneket) kell azonosítani a vizsgálat során. Meg kell jegyezni, hogy az RdPd-génnek egy bizonytalan pozíciója van (“ingatag”) az előrelapozóban (R=G/A),két bizonytalan pozíció a fordított alapozóban (R=G/A; S=G/C), és három bizonytalan pozíciója van az RdRp-szondában (W=A/T; R=Fő/A; M=A/C). Tehát, két különböző előre primerek, négy különböző fordított primerek, és nyolc különböző szondák lehet szintetizálni a RdPd-gén. Együtt 64 lehetséges combinációk primerek és szondák!

A Corman-Drosten-papír továbbá egy harmadik gént is azonosít, amelyet a WHO protokollja szerint nem validáltak tovább, és szükségtelennek ítélt:

“Megjegyzés: az N génvizsgálatot is jól teljesített, de nem volt kitéve intensive további validálásnak, emiatt valamivel kevésbé érzékeny.”

Ez egy szerencsétlen mulasztás volt, mivel a legjobb lenne mindhárom gén PCR-t megerősítő vizsgálatként használni, és ez majdnem elegendő vírus RNS kimutatás diagnosztikai tool protokollt eredményezett volna. Három megerősítő vizsgálati lépés legalább minimalizálná a hibákat és a bizonytalanságokat minden egyes lépésnél a „Wobbly” -pontok tekintetében. (Mindazonáltal a protokoll még mindig elmarad a „jó laboratóriumi gyakorlattól”, ha figyelembe vesszük az összes többi tervezési hibát.)

A jelenlegi állás szerint az N génvizsgálatot sajnálatos módon nem javasolják a WHO-ajánlásban (1. ábra), mint kötelező és döntő harmadik megerősítő lépést, és a Corman-Drosten-dokumentumban sem hangsúlyozzák, minta “rutin munkafolyamathoz” (2. táblázat).

Következésképpen a világ szinte minden vizsgálati eljárásában csak 2 alapozó egyezést használtak mindhárom helyett. Ez a felügyelet a teljes vizsgálati protokollt használhatatlanná teszi apontos vizsgálati eredmények elérése tekintetében egyfolyamatban lévő világjárványban.

1. ábra: Az N-Gene megerősítő-vizsgálat nem hangsúlyozta, mint szükséges harmadik lépés a hivatalos WHO Drosten-Corman protokoll-ajánlás alatt [8], és nem szükséges, mint egy döntő lépés nagyobb vizsgálati pontossághoz az Eurosurveillance kiadványa.

1c) Hibás GC-tartalom (a 2c. Pontban tárgyaltuk, a hőkezelési hőmérséklettel (Tm) együtt)

1d) Vírusgének kimutatása
Az RT-PCR nem ajánlott a fertőzés elsődleges diagnosztikájához. Ezért a klinikai rutinban a COVID-19 kimutatására alkalmazott RT-PCR teszt szabályozási alapon nem javallt a COVID-19 diagnosztizálására.

„A klinikusoknak fel kell ismerniük a fertőzések diagnosztizálásához szükséges molekuláris diagnosztikai technikák fokozott pontosságát és sebességét, de meg kell érteniük korlátjaikat is. A laboratóriumi eredményeket mindig a beteg klinikai bemutatásának összefüggésében kell értelmezni, és a megbízható vizsgálati eredményekhez megfelelő mintavételi hely, minőség és a mintavétel időzítése szükséges ”. [9]

Használható azonban az orvos differenciáldiagnózisának megsegítésére, amikor különbséget kell tennie a tüdő különböző fertőzései között (az influenza, a Covid-19 és a SARS nagyon hasonló tünetekkel jár). Egy adott vírus megerősítő diagnosztizálásához legalább 3 specifikus primer párt kell alkalmazni 3 vírusspecifikus gén kimutatására. Ezeket a célgéneket előnyösen a lehető legnagyobb távolságban kell elhelyezni a vírusgenomban (az ellentétes végeket is beleértve).

Bár a Corman-Drosten tanulmány  3 alapozót ír le, ezek az alapozók csak a vírus genomjának nagyjából felét fedik le. Ez egy másik tényező, amely csökkenti az ép  COVID-19 vírus RNS kimutatásának sajátosságait, és növeli a hamis pozitív vizsgálati eredményeket.

Ezért, még ha három pozitív jelet is kapunk (vagyis a három primer pár 3 különböző amplifikációs terméket ad) egy mintában, ez nem bizonyítja a vírus jelenlétét. Egy jobb primer kialakítás esetén a vírusgenom mindkét végén terminális primerek találhatók. Ez azért van, mert az egész vírusgenom lefedve lenne, és három pozitív jel jobban megkülönböztetheti a teljes (és így potenciálisan fertőző) vírust és a töredezett vírusgenomot (fertőző hatás nélkül). Annak érdekében, hogy bármi lényeges következtetést levonhassunk a vírus fertőzőképességéről, célként az Orf1 gént kellett volna bevonni, amely a SARS-CoV vírusok esszenciális replikáz enzimét kódolja (2. ábra). A protokoll másik gyengesége a célpontok elhelyezkedése a vírusgenom azon régiójában, amelyet a legerősebben és legváltozatosabban átírnak.

Kim és mtsai. demonstrálják a szubgenomikus RNS erősen változó 3 ’expresszióját a Sars-CoV-2-ben [23]. Ezeket az RNS-eket aktívan figyelik, mint tünetmentes és nem fertőző betegek aláírását [10]. Nagyon megkérdőjelezhető olyan tünetmentes emberek populációjának szűrése olyan qPCR primerekkel, amelyek 6 primer-dimer primer-dimerrel rendelkeznek a primer 3 elsődleges végén (3. ábra).

Nyilvánvalóan a WHO ajánlja ezeket a primereket. A Corman-Drosten papír összes ingadozását megvizsgáltuk a Thermofisher primer dimer web eszközével [11]. Az RdRp forward primer 6 bp 3prime homológiát mutat a Sarbeco E Reverse-rel. Magas alapozó koncentrációk esetén ez elegendő a pontatlanságok kialakításához.

Megjegyzendő: Az N primerek egyike tökéletesen illeszkedik egy klinikai kórokozóhoz (Pantoea), amelyet immunhiányos betegeknél találnak. A fordított primer eléri a Pantoea-t is, de nem ugyanabban a régióban (3. ábra).

Ezek súlyos tervezési hibák, mivel a teszt nem tud különbséget tenni az egész vírus és a  vírusdarabok között. A teszt nem használható SARS-vírusok diagnosztikára.

 

2 ábra: Az amplikon célok relatív helyzete a SARS-koronavírussal és a 2019-es új koronavírus genomnal kapcsolatban.

 

  1. ORF: nyitott olvasókeret; RdRp: RNS-függő RNS polimeráz. Az amplikon alatti számok genompozíciók a SARS-CoV, NC_004718 [1] szerint; 3. ábra: A Thermofischer primer dimer webes eszközével kapcsolatos teszt azt mutatja, hogy az RdRp előre alapozó 6bp 3’prime homológiával rendelkezik Sarbeco E Reverse (bal oldali doboz) segítségével. Egy másik vizsgálat azt mutatja, hogy van egy tökéletes egyezés az egyik N-primers egy klinikai kórokozó (Pantoea) található immunhiányos betegek (jobb doboz).
Figure 3: A test with Thermofischer’s primer dimer web tool reveals that the RdRp forward primer has a 6bp 3`prime homology with Sarbeco E Reverse (left box). Another test reveals that there is a perfect match for one of the N-primers to a clinical pathogen (Pantoea) found in immuno-compromised patients (right box).

A  cikk folytatása 3. oldal>>>

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail címet nem tesszük közzé. A kötelező mezőket * karakterrel jelöltük