Leszámolás a PCR teszttel
2. Reakció hőmérséklete 2a) DNS olvadási hőmérséklet (>92°).
Megfelelően foglalkozott a Corman-Drosten papíron.
2b) DNS erősítő hőmérséklet.
Megfelelően foglalkozik a Corman-Drosten papír.
2c) Hibás GC-tartalom és Tm A lágyítási hőmérséklet határozza meg, hogy az alapozó melyik
hőmérsékleten kötődik/kósál a célsorozattól. A hatékony és specifikus erősítés érdekében az alapozók GC-tartalmának meg kell felelnie legalább 40%-nak, de legfeljebb 60%-os erősítésnek. A3. Két alapozó (RdRp_SARSr_F és RdRp_SARSr_R) szokatlan és nagyon alacsony, 28–31%-os GC-értékkel rendelkezikaz imbolygó bázisok minden lehetséges változatára, a whereas primer E_Sarbeco_F GC értéke 34,6% (a 3. táblázat 3. táblázata és a 3. táblázat második panelje). Meg kell jegyezni, hogy a GC-tartalom nagymértékben meghatározza az egyedi célhoz való kötődést az alappárosításban való három hidrogénkötése miatt. Így minél alacsonyabb az alapozó GC-contentje, minél alacsonyabb a kötőképessége a konkrét cél génszekvenciára (azaz a kimutatható génre). Ez azt jelenti, hogy a cél-szekvencát ismerni kell, meg kell választani a hőmérsékletet, amely a lehető legközelebb áll a ténylegeslágyítási hőmérséklethez (legjobb gyakorlat-érték) a primer, hogy ne válassza ki újra, miközben kifejezetten kiválasztja a célsorozatot.
Ha a Tm-érték nagyon alacsony, amint azt az RdRp fordított primerek összes ingatag változata megfigyeli, az alapozók nem kifejezetten több célhoz kötődnek, csökkentve a specificitást és növelve a potenciális hamis pozitív eredményeket.
A lágyítási hőmérséklet (Tm) döntő tényező a qPCR eljárás specificitásának/pontosságának meghatározásában,és elengedhetetlen aqPCR-protokollok pontosságának kiértékelésében. Legjobb gyakorlatra vonatkozó ajánlás: Mindkét alapozónak (előre és hátra) majdnem hasonló értékkel kell, hogy legyen, lehetőleg azonos értékkel.
A szabadon elérhető Primer-BLAST tervezőszoftvert [12, 25] arra használtuk, hogy aCorman-Drosten papírban használt összes alapozó számára elérhető legjobb gyakorlatokat nyújtsuk (3. táblázat). Megpróbáltunk 60°C-os Tm-értéket találni, miközben a lehető legmagasabb GC% értéket kerestükminden alapozó számára. A primer párokon belül 2°C-os maximális Tm-különbséget elfogadhatónak ítélték. A Corman-Drosten papírban meghatározott primer párokat vizsgálva 10 °C-os különbséget figyeltünk meg az alapozó pár Tm lágyítási hőmérséklete1 (RdRp_SARSr_F és RdRp_SARSr_R). Ez egy nagyon súlyos hiba, és makes a protokoll haszontalan, mint egy adott diagnosztikai eszköz. A további vizsgálatok azt mutatták, hogy csak az
N-gén felerősítésére tervezett primerpár (N_Sarbeco_F és N_Sarbeco_R) érte el a diagnosztikai vizsgálathoz szükséges megfelelő szabványt,mivel elegendő GC-tartalommal rendelkezik, és azalapozók (N_Sarbeco_F és N_Sarbeco_R) közötti Tm különbség 1,85 ° C (a döntő maximum 2°C-os különbség alatt). Fontos, hogy ez az a gén, amelyet nem vizsgáltak meg a vírusmintákban (2. táblázat), és nem hangsúlyozták megerősítő vizsgálatként. A rendkívül változó olvadási hőmérsékletek és a degenerált szekvenciák mellett ezekben az alapozókban van egy másik tényező is, amely befolyásolja az eljárás sajátosságait: a dNTP-k (0,4uM) 2-szekkel magasabbak, mint egynagyonspecifikus erősítéshez ajánlottak. A reakcióhoz további magnézium-szulfátot is hozzáadnak. Ez az eljárás együtt alacsony lágyítási hőmérséklet hozhat létre nem specifikus erősítés. Ha további magnéziumra van szükség a qPCR-hez, a vizsgálat specifikusságáttovább kell vizsgálni.
Az itt leírt tervezési hibák olyan súlyosak, hogy nagyon valószínűtlen, hogy a SARS-CoV-2 genetikai anyag specifikus erősítése a Corman-Drosten papír protokollja alapján fog bekövetkezni.
3. Az erősítési ciklusok száma
Meg kell jegyezni,hogy a Corman-Drosten dolgozatban sehol sem említik, hogy egy teszt pozitív vagy negatív lenne, vagy hogy mi határozza meg a pozitív vagy negatív eredményt. Az o fvirológiai diagnosztikai vizsgálatoknak SOP-n kell alapulnia, beleértve a PCR-ciklusok validált és rögzített számát (Ct érték), amely után a minta pozitívnak vagy negatívnak minősül. Az ésszerűen megbízható Ct maximális értéke 30 ciklus. A Ct felett 35 ciklus, rapidly egyre több hamis pozitív várható .A 35 ciklusos CT-érték után pozitívként értékelt PCR-adatok teljesen megbízhatatlanok.
Hivatkozva Jaafar et al. 2020 [3]:
“Ct = 35-nél az az érték, amelyet a PCR pozitív eredményének beszámolásához használtunk, a tenyészetek <3% -a pozitív.”
Más szóval, a SARS-CoV-2 sikeres vírusizolálása nem történt meg ezeken a magas Ct értékeken. Továbbá tudományos tanulmányok azt mutatják, hogy csak nem fertőző (elhalt) vírusokat detektálnak 35 Ct-értékkel [22].
30 és 35 között van egy szürke terület, ahol a pozitív teszt nem állapítható meg biztosan. Ezt a területet ki kell zárni. Természetesen 45 PCR-ciklust lehet végrehajtani, amint azt a Corman-Drosten WHO-protokoll javasolja (4. ábra), de akkor meg kell adnia egy ésszerű Ct-értéket is (amely nem haladhatja meg a 30-at). De a 45 Ct értékű analitikai eredmény tudományosan és diagnosztikailag abszolút értelmetlen (az ésszerű Ct érték nem haladhatja meg a 30 értéket). Mindezt nagyon világosan közölni kell. Jelentős hiba, hogy a Corman-Drosten cikk nem említi azt a maximális Ct értéket, amelynél a minta egyértelműen pozitív vagy negatív vizsgálati eredménynek tekinthető. Ezt a fontos ciklusküszöb-korlátot az eddigi nyomon követési beadványokban sem határozzák meg.
- Biomolekuláris validációk
Annak megállapításához, hogy az amplifikált termékek valóban SARS-CoV-2 gének-e, elengedhetetlen az amplifikált PCR-termékek biomolekuláris validálása. Diagnosztikai tesztnél ez az érvényesítés feltétlenül szükséges.
A PCR-termékek validálását úgy kell végrehajtani, hogy a PCR-terméket 1% -os agaróz-EtBr gélben futtatjuk méretmérővel (DNS-vonalzó vagy DNS-létra) együtt, hogy megbecsülhető legyen a termék mérete. A méretnek meg kell felelnie az amplifikációs termék kiszámított méretének. De még jobb, ha az amplifikációs terméket szekvenáljuk. Ez utóbbi 100% -os bizonyosságot ad az amplifikációs termék azonosságával kapcsolatban. Molekuláris validálás nélkül nem lehet biztos az amplifikált PCR-termékek azonosságában. Figyelembe véve a korábban leírt súlyos tervezési hibákat, az amplifikált PCR-termékek bármi lehetnek.
A Corman-Drosten cikkben nem említik a qPCR apró töredékeit (kb. 100 bp): Ez lehet akár 1,5% -os agarózgél vagy akár akrilamid-gél is.
Az a tény, hogy ezeket a PCR-termékeket nem validálták molekuláris szinten, a protokoll másik feltűnő hibája, amely minden, az arra épülő tesztet használhatatlanná tesz, mint speciális diagnosztikai eszközt a SARS-CoV-2 vírus azonosítására.
5. Pozitív és negatív kontrollok a specifikus vírus kimutatás megerősítésére / cáfolására.
A Corman-Drosten cikkben leírt meg nem erősített feltételezés szerint a SARS-CoV-2 az egyetlen vírus a SARS-szerű béta-koronavírus csoportból, amely jelenleg emberben okoz fertőzéseket. A PCR-módszerük alapjául szolgáló szekvenciák in silico szekvenciák, amelyeket egy kínai laboratórium szállított [23], mivel a PCR-teszt kifejlesztésének idején nem volt fertőző („élő”) vagy inaktivált SARS-CoV- 2 a szerzők rendelkezésére állt. A PCR-tesztet ezért úgy tervezték, hogy az ismert SARS-CoV szekvenciáját használták kontrollanyagként a Sarbeco komponens számára (Dr. Meijer, társszerző Corman-Drosten cikk Dr. Peter Borgerrel folytatott e-mail-csere során) [2].
A Corman-Drosten cikkben leírtak szerint az RT-PCR teszttel pozitívan tesztelt összes személyt feltételezzük, hogy pozitív a SARS-CoV-2 fertőzések szempontjából. Feltételezésükben három súlyos hiba van. Először is, a Corman-Drosten cikkben leírt RNS-molekulák pozitív tesztje nem egyenértékű a „vírusfertőzéssel”. A pozitív RT-PCR teszt csupán a vírusos RNS molekulák jelenlétét jelzi. Amint az a fenti 1d. Pontból kiderül, a Corman-Drosten tesztet nem a teljes hosszúságú vírus, hanem csak a vírus egy részének kimutatására tervezték. Már arra a következtetésre jutottunk, hogy ez a tesztet alkalmatlannak minősíti a SARS-vírusfertőzések diagnosztikai tesztjeként.
Másodsorban és nagyon fontos, hogy a publikált RT-PCR teszt funkcionalitását nem sikerült kimutatni pozitív kontroll (izolált SARS-CoV-2 RNS) alkalmazásával, amely elengedhetetlen tudományos aranystandard.
Harmadszor, a Corman-Drosten cikk kimondja:
„Annak bemutatására, hogy a vizsgálatok képesek-e más denevérrel társított SARS-sel kapcsolatos vírusok kimutatására, az E gén vizsgálattal hat denevér eredetű székletmintát teszteltünk Drexler et al. […] Und Muth et al. […]. Ezek a vírus-pozitív minták európai rhinolophid denevérekből származtak. Ezeknek a filogenetikai kiugrásoknak a felderítése a SARS-val kapcsolatos CoV kládon belül arra utal, hogy valószínűleg minden ázsiai vírust kimutatnak. Ez elméletileg széles érzékenységet biztosítana még abban az esetben is, ha a vírusvariánsok többszörös független megszerzése történik egy állattározóból. “
Ez az állítás azt mutatja, hogy az RT-PCR-vizsgálatban használt E gén a Corman-Drosten papírban leírtak szerint nem specifikus a SARS-CoV-2-re.
Az E gén primerek más SARS vírusok széles spektrumát is kimutatják.
A koronavírus genomja a legnagyobb az embert megfertőző RNS vírusok közül, és mindegyikük nagyon hasonló molekulaszerkezettel rendelkezik. Ennek ellenére a SARS-CoV1 és a SARS-CoV-2 két nagyon specifikus genetikai ujjlenyomattal rendelkezik, amelyek megkülönböztetik őket a többi koronavírustól. Először is, egy egyedi ujjlenyomat-szekvencia (KTFPPTEPKKDKKKK) van jelen a SARS-CoV és a SARS-CoV-2 N-fehérjéjében [13,14,15]. Másodszor, a SARS-CoV1 és a SARS-CoV2 sem tartalmazza a HE fehérjét, míg az összes többi koronavírus rendelkezik ezzel a génnel [13, 14]. Tehát a SARS-CoV1 és a SARS-CoV-2 PCR termék specifikus kimutatásához amplifikációs célként az N gén fenti régióját kellett volna választani. Megbízható tesztként egy megbízható diagnosztikai vizsgálatnak az N-gén ezen specifikus régiójára kell összpontosítania. Ennek az N-génnek a PCR-jét a Drosten-Corman-papír nem validálta tovább, és nem is javasolta tesztgénként, mert „nem volt annyira érzékeny” az eredeti SARS-CoV szondával [1].
Továbbá, a HE gén hiánya mind a SARS-CoV1, mind a SARS-CoV-2-ben teszi ezt a gént ideális negatív kontrollként a többi koronavírus kizárására. A Corman-Drosten papír nem tartalmazza ezt a negatív kontrollt, és nem tartalmaz más negatív kontrollt sem. A Corman-Drosten cikkben szereplő PCR-teszt tehát nem tartalmaz sem egyedi pozitív kontrollt, sem pedig negatív kontrollt a többi koronavírus jelenlétének kizárására. Ez egy másik jelentős tervezési hiba, amely a vizsgálatot alkalmatlannak minősíti a diagnózisra.
6. A szabványos működési eljárás (SOP) nem áll rendelkezésre
Rendelkeznie kell egy szabványos működési eljárással (SOP), amely egyértelműen meghatározza a fenti paramétereket, hogy minden laboratórium azonos vizsgálati körülményeket tudjon létrehozni. A validált univerzális SOP megléte elengedhetetlen, mert megkönnyíti az adatok összehasonlítását országon belül és között. Nagyon fontos az összes primer paraméter egyértelmű megadása. Megjegyezzük, hogy ez nem történt meg. Továbbá nincs meghatározva a Ct érték, amely jelzi, hogy egy mintát mikor kell pozitívnak vagy negatívnak tekinteni. Azt sem határozzák meg, ha a minta SARS-CoV vírusokkal fertőzöttnek tekinthető. Amint a fentiekből látható, a teszt nem képes megkülönböztetni a vírust és a vírusfragmenseket, ezért a pozitivitásra utaló Ct-érték döntő fontosságú. Ezt a Ct értéket meg kellett volna adni a szabványos működési eljárásban (SOP), és online állapotba kell helyezni, hogy minden, a vizsgálatot végző laboratóriumnak pontosan ugyanazok legyenek a peremfeltételei. Hibás tudományra mutat, hogy ilyen SOP nem létezik. A laboratóriumok tehát szabadon elvégezhetik a vizsgálatot, amelyet megfelelőnek tartanak, ami óriási mennyiségű variációt eredményez. A laboratóriumok egész Európában számos kérdéssel maradnak; melyik alapozót kell megrendelni? mely nukleotidokat kell kitölteni a meghatározatlan helyeken? melyik Tm értéket válassza? Hány PCR ciklust kell futtatni? Milyen Ct értéknél pozitív a minta? És mikor negatív? És hány gént kell tesztelni? Minden gént tesztelni kell, vagy csak az E és az RpRd gént, amint azt a Corman-Drosten cikk 2. táblázata mutatja? Meg kell vizsgálni az N gént is? És mi a negatív kontrolljuk? Mi a pozitív kontrolljuk?
A leírt protokoll sajnos nagyon homályos és hibás felépítésű, hogy több tucat különböző irányba lehet haladni. Úgy tűnik, hogy nincs sem szabványosítás, sem SOP, ezért nem világos, hogyan lehet ezt a tesztet végrehajtani.
7. Az 1-5. Szakaszban leírt hibák következményei: hamis pozitív eredmények.
A Corman-Drosten cikkben leírt RT-PCR teszt annyi molekuláris biológiai tervezési hibát tartalmaz (lásd 1–5), hogy nem lehet egyértelmű eredményeket elérni. Elkerülhetetlen, hogy ez a teszt óriási számú úgynevezett „hamis pozitív” eredményt generáljon. A hamis pozitívok definíciója negatív minta, amely kezdetben pozitív eredményt ad, de amely negatív az azonos teszttel végzett újbóli tesztelés után. A hamis pozitív eredmények hibás pozitív teszt-eredmények, azaz negatív minták, amelyek pozitív eredményt mutatnak. És ez valóban megtalálható a Corman-Drosten cikkben. A kézirat PDF-fájljának 6. oldalán a szerzők kimutatták, hogy jól ellenőrzött laboratóriumi körülmények között is jelentős százalékban hamis pozitívak keletkeznek ezzel a teszttel:
„Négy egyedi vizsgálati reakcióban gyenge kezdeti reaktivitás volt tapasztalható, azonban negatívak voltak, ha ugyanazzal a vizsgálattal újra tesztelték. Ezek a jelek nem kapcsolódtak egyetlen vírushoz sem, és minden olyan vírus esetében, amelynél a kezdeti pozitív reaktivitás bekövetkezett, volt más minta, amely ugyanazt a vírust tartalmazta magasabb koncentrációban, de nem volt pozitív. Tekintettel a fent leírt kiterjedt műszaki minősítés eredményeire, arra a következtetésre jutottak, hogy ez a kezdeti reaktivitás nem a valós idejű PCR-szondák kémiai instabilitásának és valószínűleg az új diagnosztikai tesztek és kontrollok ezen értékelés során történő gyors bevezetése által okozott problémáknak volt köszönhető. tanulmány.” [1]
A kivonat első mondata egyértelmű bizonyíték arra, hogy a Corman-Drosten cikkben leírt PCR-teszt hamis pozitív eredményeket generál. Még a korszerű Charité-laboratórium jól ellenőrzött körülményei között is, a 310 primer tesztből 4 definíciónként hamis pozitív. Négy negatív minta eredetileg pozitív volt, majd az újratesztelés során negatív volt. Ez a hamis pozitív klasszikus példája. Ebben az esetben a szerzők nem azonosítják őket hamis pozitívként, ami intellektuálisan tisztességtelen.
Egy másik árulkodó megfigyelés a fenti részletben az, hogy a szerzők a hamis pozitív eredményeket úgy magyarázzák, hogy “az új diagnosztikai tesztek gyors bevezetése által okozott problémák kezelése”. Képzeljük el azokat a laboratóriumokat, amelyeknek be kell vezetniük a tesztet az összes szükséges információ nélkül, amelyet az SOP általában leír.
8. A Corman-Drosten cikket nem értékelték szakértőkkel
A tudományos folyóiratban való hivatalos megjelenés előtt a tudományos és orvosi cikkeket hagyományosan „szakértői értékelés” tanúsítja. Ebben a folyamatban a folyóirat szerkesztői különféle szakértőktől („bíróktól”) vesznek tanácsot, akik értékelték a papírt, és feltárhatják a feltevések, módszerek és következtetések gyengeségeit. A folyóirat általában csak akkor tesz közzé cikket, ha a szerkesztők meggyőződtek arról, hogy a szerzők megoldották a játékvezetők aggályait, és hogy a bemutatott adatok alátámasztják a cikkben levont következtetéseket. ” Ezt a folyamatot az Eurosurveillance esetében is leírják [16].
A Corman-Drosten cikket 2020. január 21-én nyújtották be az Eurosurveillance felé, és 2020. január 22-én elfogadták közzétételre. 2020. január 23-án a cikk online volt. 2020. január 13-án a WHO hivatalos honlapján [17] közzétették a protokoll 1–0-s verzióját, amelyet 2020. január 17-én frissítettek a 2-1. Dokumentumváltozatként [18], még mielőtt a Corman-Drosten cikk január 23-án megjelent volna. Eurófelügyelet.
Általában a szakértői értékelés időigényes folyamat, mivel a terület legalább két szakértőjének kritikusan el kell olvasnia és kommentálnia kell a benyújtott cikket. Véleményünk szerint ezt a cikket nem értékelték szakértőkkel. Huszonnégy óra egyszerűen nem elegendő az alapos szakértői értékelés elvégzéséhez. Következtetésünket alátámasztja, hogy óriási számú nagyon súlyos tervezési hibát találtunk, amelyek a PCR-tesztet teljesen alkalmatlanná teszik diagnosztikai eszközként a SARS-CoV-2 vírus azonosítására. Bármely molekuláris biológus, aki ismeri az RT-PCR tervezését, könnyedén megfigyelte volna a Corman-Drosten cikkben szereplő súlyos hibákat a tényleges felülvizsgálati folyamat előtt. 2020. október 26-án arra kértük az Eurosurveillance-t, hogy küldjön nekünk egy másolatot a szakértői véleményről. A mai napig nem kaptuk meg ezt a jelentést, és 2020. november 18-án kelt levelében az ECDC, mint az Eurosurveillance házigazdája, elutasította a hozzáférés biztosítását anélkül, hogy döntését jelentős tudományos okokkal indokolta volna. Épp ellenkezőleg, azt írják, hogy „a nyilvánosságra hozatal aláásná a tudományos vizsgálatok célját”. [24].
9. A szerzők, mint szerkesztők
Az utolsó pont az egyik legnagyobb aggodalomra ad okot. Kiderült, hogy a Corman-Drosten cikk két szerzője, Christian Drosten és Chantal Reusken is tagja ennek a folyóiratnak a szerkesztőségében [19]. Ezért súlyos összeférhetetlenség áll fenn, amely megerősíti a gyanút, hogy a cikket nem értékelték szakértőkkel. Úgy tűnik, hogy a gyors közzététel pusztán azért volt lehetséges, mert a szerzők az Eurosurveillance szerkesztőségében is részt vettek. Ezt a gyakorlatot a tudományos integritást veszélyeztető kategóriába sorolják.
A DOLGOZATBAN TALÁLT HIBÁK ÖSSZEFOGLALÓ KATALÓGUSA
A Corman-Drosten cikk a következő hibákat tartalmazza:
1. Nincs különösebb ok arra, hogy ezeket a rendkívül magas koncentrációjú primereket felhasználjuk ebben a protokollban. A leírt koncentrációk megnövekedett nem specifikus kötődésekhez és PCR-termék-amplifikációkhoz vezetnek, ami a teszt alkalmatlanná teszi a SARS-CoV-2 vírus azonosítására szolgáló specifikus diagnosztikai eszközként.
2. Hat meg nem határozott ingatag helyzet óriási változékonyságot vezet be a teszt valós laboratóriumi megvalósításaiban; a Corman-Drosten cikkben szereplő zavaros, nem specifikus leírás nem megfelelő szabványos működési protokollként, így a teszt alkalmatlan a SARS-CoV-2 vírus azonosítására szolgáló specifikus diagnosztikai eszközként.
3. A teszt nem tehet különbséget az egész vírus és a vírusfragmensek között. Ezért a teszt nem használható ép (fertőző) vírusok diagnosztikájaként, ezért a teszt alkalmatlanná válik speciális diagnosztikai eszközként a SARS-CoV-2 vírus azonosítására és a fertőzés jelenlétére vonatkozó következtetések levezetésére.
4. Az 1-es primerpár (RdRp_SARSr_F és RdRp_SARSr_R) Tm hőkezelési hőmérsékletének 10 ° C-os különbsége szintén alkalmatlanná teszi a vizsgálatot specifikus diagnosztikai eszközként a SARS-CoV-2 vírus azonosítására.
5. Súlyos hiba az a Ct érték kihagyása, amelynél a mintát pozitívnak és negatívnak tekintik. Ez a Ct érték nem található meg a nyomon követési beadványokban, amelyek miatt a teszt alkalmatlan a SARS-CoV-2 vírus azonosítására szolgáló specifikus diagnosztikai eszközként.
6. A PCR-termékeket molekuláris szinten nem validálták. Ez a tény használhatatlanná teszi a protokollt, mint speciális diagnosztikai eszközt a SARS-CoV-2 vírus azonosítására.
7. A PCR-teszt nem tartalmaz sem egyedi pozitív kontrollt annak SARS-CoV-2 specifitásának értékelésére, sem negatív kontrollt, hogy kizárja más koronavírusok jelenlétét, ami a vizsgálatot alkalmatlanná teszi a SARS-CoV-2 azonosítására szolgáló specifikus diagnosztikai eszközként vírus.
8. A Corman-Drosten cikkben szereplő tesztterv annyira homályos és hibás, hogy több tucat különböző irányba lehet haladni; semmi nincs szabványosítva és nincs SOP. Ez erősen megkérdőjelezi a teszt tudományos érvényességét, és alkalmatlanná teszi a SARS-CoV-2 vírus azonosítására szolgáló speciális diagnosztikai eszközként.
9. Valószínűleg a Corman-Drosten cikket nem értékelték szakértői értékeléssel, így a teszt alkalmatlan volt a SARS-CoV-2 vírus azonosítására szolgáló speciális diagnosztikai eszközként.
10. Súlyos összeférhetetlenséget tapasztalunk legalább négy szerzőnél, azon túl, hogy a Corman-Drosten cikk szerzői közül kettő (Christian Drosten és Chantal Reusken) az Eurosurveillance szerkesztőségének tagja. 2020. július 29-én összeférhetetlenséggel bővült (Olfert Landt a TIB-Molbiol vezérigazgatója; Marco Kaiser a GenExpress vezető kutatója és a TIB-Molbiol tudományos tanácsadója), amelyet az eredeti változat nem deklarált (és még mindig hiányzik a PubMed verzióból); A TIB-Molbiol az a cég, amely „elsőként” gyártott PCR készleteket (Light Mix) a Corman-Drosten kéziratban közzétett protokoll alapján, és saját szavaik szerint a PCR-tesztkészleteket a kiadvány megjelenése előtt terjesztették. még benyújtotta is [20]; továbbá Victor Corman és Christian Drosten nem említette második hovatartozását: a „Labor Berlin” kereskedelmi tesztlaboratóriumot. Mindkettő felelős az ottani vírusdiagnosztikáért [21], és a vállalat a valós idejű PCR-tesztelés területén működik.
A Corman-Drosten cikkben leírt SARS-CoV-2 azonosítására szolgáló vizsgálati protokoll felülvizsgálatának fényében olyan hibákat és eredendő tévedéseket azonosítottunk, amelyek haszontalanná teszik a SARS-CoV-2 PCR tesztet.
Hivatkozások
[1] Corman Victor M, Landt Olfert, Kaiser Marco, Molenkamp Richard, Meijer Adam, Chu Daniel KW, Bleicker Tobias, Brünink Sebastian, Schneider Julia, Schmidt Marie Luisa, Mulders Daphne GJC, Haagmans Bart L, van der Veer Bas, van den Brink Sharon, Wijsman Lisa, Goderski Gabriel, Romette Jean-Louis, Ellis Joanna, Zambon Maria, Peiris Malik, Goossens Herman, Reusken Chantal, Koopmans Marion PG, Drosten Christian. A 2019-es új koronavírus (2019-nCoV) kimutatása valós idejű RT-PCR-sel. Euro Surveill. 2020;25(3):p ii=2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045
[2] Dr. Peter Borger és Dr. Adam Meijer e-mail kommunikációja: Kiegészítő anyagok
[3] Jafaar et al., Korreláció között 3790 kvantitatív polimeráz láncreakció-pozitív minták és pozitív sejttenyészetek, beleértve az 1941 súlyos akut légzőszervi szindróma koronavírus 2 izolátumok. https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603 https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603
[4] BBC, 2020. január 21.: https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51185836;
Archívum: https://archive.is/0qRmZ
[5] Google Analytics – COVID19-halálesetek világszerte: https://bit.ly/3fndemJ
Archívum: https://archive.is/PpqEE
[6] A COVID-19 katasztrófaelhárítási műszaki centre, NIVD laboratóriumi vizsgálata
Kína CDC 2020. március 15.: http://www.chinacdc.cn/en/COVID19/202003/P020200323390321297894.pdf
[7] Valós idejű PCR kézikönyv Life Technologies: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-
Nolan T, Huggett J, Sanchez E.Good practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR) First Edition 2013
[8] Trestan Pillonel et al, Levél a szerkesztőnek: SARS-CoV-2 észlelés valós idejű RT-PCR-sel: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/
[9] Kurkela, Satu és David WG Brown. “Molekuláris diagnosztikai technikák.” Orvostudomány 38.10 (2009): 535-540.
[10] Wolfel és mtsai., Covid-2019-ben szenvedő kórházi betegek virológiai értékelése
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x
[11] Thermofischer Primer Dimer webeszköz: https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html
Suplementary anyag Kevin Mckernan, Corman-Drosten Primer Dimer eredmények Thermofischer Primer Dimer Web Tool
[12] Primer-BLAST, NCBI – National Center for Biotechnology Information: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
[13] Marra MA, Steven JMJ, Caroline RA, Robert AH, Angela BW et al. (2003) Tudomány. A
A SARS-sal összefüggő koronavírus genomszekvenciáját. Tudomány 300(5624): 1399-1404.
[14] Súlyos akut légzőszervi szindróma koronavírus 2 izolátum Wuhan-Hu-1, teljes genom: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947
[15] Borger P. SARS-szerű koronavírusra számítottak, de nem tettek semmit a felkészülés érdekében. Am J Biomed Sci Res 2020. https://biomedgrid.com/pdf/AJBSR.MS.ID.001312.pdf
https://www.researchgate.net/publication/341120750_A_SARS-like_Coronavirus_was_Expected_but_nothing_was_done_to_be_Prepared;
Archívum: https://archive.is/i76Hu
[16] Eurosurveillance papír értékelés / felülvizsgálati folyamat: https://www.eurosurveillance.org/evaluation
[17] A Corman-Drosten protokoll és kézirat hivatalos ajánlása a WHOáltal 2020. január 13-án a dokumentum 1.0-s verziójaként:
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus-assay-v1991527e5122341d99287a1b17c111902.pdf ;archív: https://bit.ly/3m3jXVH
[18] Hivatalos WHO-recommendation a Corman / Drosten RT-qPCR-protokollhoz, amely közvetlenül az Eurosurveillance-kiadványból származik, a 2-1.
- január 17.: https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2
[19] Eurosurveillance Szerkesztőbizottság, 2020: https://www.eurosurveillance.org/upload/site-assets/imgs/2020-09-Editorial%20Board%20PDF.pdf;
Archívum: https://bit.ly/2TqXBjX
[20] Használati utasítás LightMix SarbecoV E-gén plusz EAV Control, TIB-Molbiol & Roche Molecular Solutions, 2020. január 11.: https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_40-0776_96_Sarbeco-E-gene_V200204_09164154001 (1).pdf
Archívum, időbélyeg – 2020. január 11.: https://archive.is/Vulo5;
Archívum: https://bit.ly/3fm9bXH
[21] Christian Drosten és Victor Corman, a Labor Berlin vírusdiagnosztikáért felelős: https://www.laborberlin.com/fachbereiche/virologie/
Archívum: https://archive.is/CDEUG
[22] Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan Vírusos kultúrák a COVID-19 fertőzőképesség értékeléséhez. Szisztematikus felülvizsgálat. Rendszeres felülvizsgálat doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.04.20167932v4
[23] Kim és mtsai.,A SARS-CoV-2 architektúrája Transcriptome: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420304062
[24] ECDC válasz Dr. Borger Péternek, 2020. november 18.: Kiegészítő anyagok
[25] Prof. Dr. Ulrike Kämmerer & team, survey & Primer-BLAST táblázat: Kiegészítő anyag
További szakirodalom:
Leírás RT-PCR RKI Németország, a link 10 https://www.rki.de/DE/Content/Gesundheitsmonitoring/Gesundheitsberichterstattung/GBEDownloadsJ/JoHM_S5_2020_Studienprotokoll_CORONA_MONITORING_lokal.pdf?__blob=publicationFile.
Authori hovatartozás:
1) Dr. Pieter Borger (MSc, PhD), Molekuláris genetika, W+W kutatási munkatárs, Lörrach, Németország
2) Rajesh Kumar Malhotra (Előadó: Bobby Rajesh Malhotra), volt 3D-s előadó / Tudományos vizualizációk a CeMM-ben – Az Osztrák Tudományos Akadémia Molekuláris Orvostudományi Központja (2019-2020), Iparművészeti Egyetem – Bécsi Digitális Művészeti Tanszék, Ausztria
3) Dr. Michael Yeadon BSs (Hons) Biochem Tox U Surrey, PhD farmakológia U Surrey. Ügyvezető igazgató, Yeadon Consulting Ltd, korábbi Pfizer chief scientist, Egyesült Királyság
4) Dr. Clare Craig MA, (Cantab) BM, BCh (Oxon), FRCPath, Egyesült Királyság
5) Kevin McKernan, BS Emory Egyetem, tudományos főtisztviselő, alapító Orvosi Genomika, megtervezte a szekvenálás csővezeték WIBR / MIT a Human Genome Project, Feltalálta és kifejlesztette a SOLiD szekvenszer, odaítélt szabadalmak kapcsolatos PCR, DNS Isolation és szekvenálás, USA
6) Prof. Dr. Klaus Steger, Urológiai, Gyermek urológiai és Andrológiai Tanszék, molekuláris andrológia, Justus Liebig Egyetem Orvosbiológiai Kutatóközpont, Giessen, Németország
7) Dr. Paul McSheehy (BSc, PhD), biokémikus és industry farmakológus, Loerrach, Németország
8) Dr. Lidiya Angelova, MSc biológia, PhD mikrobiológia, Korábbi kutatója a National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), Maryland, USA
9) Dr. Fabio Franchi, korábbi Dirigente Medico (M.D) egy fertőző betegség ward, szakosodott “fertőző betegségek” és a “higiénia és megelőző orvoslás”, Società Scientifica per il Principio di Precauzione (SSPP), Olaszország
10) Dr. med. Thomas Binder, internist és kardiológus (FMH), Svájc
11) Prof. Dr. med. Henrik Ullrich, diagnosztikus radiológia szakorvos, a Collm Oschatz-Kórház Radiológiai Központjának főorvosa, Németország
12) Prof. Dr. Makoto Ohashi, professor emeritus, PhDmikrobiológia és immunológia, Tokushima Egyetem, Japán
13) Dr. Stefano Scoglio, B.Sc. Ph.D., mikrobiológus, dietetikus, Olaszország
14) Dr. Marjolein Doesburg-van Kleffens (MSc, PhD), laboratóriumi medicina (klinikai kémia), Maasziekenhuis Pantein, Beugen, Hollandia
15) Dr. Dorothea Gilbert (MSc, PhD), PhD környezeti kémia és toxikológia. DGI Consulting Services, Oslo, Norvégia
16) Dr. Rainer J. Klement, PhD. Sugár onkológiai Osztály, Leopoldina Kórház Schweinfurt, Németország
17) Dr. Ruth Schruefer, PhD, humángenetika/ immunológia, München, Németország,
18) Dra. Berber W. Pieksma, háziorvos, Hollandia
19) Dr. med. Jan Bonte (GJ), tanácsadó neurológus, Hollandia
20) Dr. Bruno H. Dalle Carbonare (Molekuláris biológiaist), IP specialista, BDC Basel, Svájc
21) Dr. Kevin P. Corbett, MSc Nursing (Kings College London) PhD (London South Bank) Társadalomtudományok (Science & Technology Studies) London, Anglia, Egyesült Királyság
22) Prof. Dr. Ulrike Kämmerer,virológia / immunológia / humánbiológia / sejtbiológia, Würzburg Egyetemi Kórház, Németország
A szerző hozzájárulásai:
PB: Megtervezte és elvégezte az elemzéseket és a kutatást, koncepcionálisan elemezte a kéziratot.
BRM: Megtervezte és elvégezte a kutatást,koncepcionálisan a számokat és a kéziratot.
MY: Elvégeztem az elemzéseket és a kutatást.
KMcK: Elemezték és kutattak, konceptualizálták a kéziratot.
KS: Elvégezte az elemzéseket és a kutatást.
PMcS: Lektorálás az elemzések és a kutatás.
LA: Lektorálása az elemzések és a kutatás.
FF: Az elemzések és a kutatás lektorálása.
TB: Az elemzések és a kutatás lektorálása.
HU: Az elemzések és kutatások lektorálása.
MO: Az elemzések és a kutatás lektorálása.
SS: Az elemzések és a kutatás lektorálása.
MDvK: Az elemzések és a kutatás lektorálása.
Főigazgatóság: Az elemzések és a kutatás lektorálása.
RJK: Az elemzések és kutatások lektorálása.
RS: Lektorálása az elemzések és a kutatás, és a kézirat.
BWK: Az elemzések és a kutatás lektorálása.
RvV: Az elemzések és kutatások lektorálása.
JB: Az elemzések és a kutatás lektorálása.
KC: Lektorálás az elemzések és a kutatás.
Egyesült Királyság: Megtervezte és elvégezte az elemzéseket és a kutatást, konceptualizálva a manuforgatókönyvet.
További proof-olvasók:
Saji N Hameed, Környezetvédelmi Informatika, Aizu Egyetem, Tsuruga, Ikki-machi, Aizuwakamatsu-shi, Fukushima, Japán
Howard R. Steen, MA Chem. Eng. Cantab, korábbi kutatási vezető, Németország
